Năm 1600, tháng 10, bà kết hôn với Quốc vương Henry IV của Pháp, ngay sau khi diễn ra sự hủy hôn giữa Quốc vương và người vợ trước đó, Vương hậu Marguerite de Valois, Vương hậu Pháp. Buổi hôn lễ diễn ra tại Lyon, Pháp với 4.000 khách và được trang hoàn đầu tư cực kì xa hoa, bao gồm cả việc biểu diễn vở opera mới nhất của Jacopo Peri, Euridice. Năm 1601, bà sinh ra người con trai đầu lòng tại Fontainebleau, tức Quốc vương Louis XIII của Pháp.

Cuộc hôn nhân để lại nhiều người thừa kế, nhưng tương tự với cuộc hôn nhân trước đó của Henry IV, bà gặp nhiều vấn đề với chồng mình. Việc bà thường xuyên tranh chấp với tình nhân của chồng khiến triều đình Pháp nhiều phen xôn xao. Và trong đó, bà hay buông lời cãi vã nhất với Catherine Henriette de Balzac d'Entragues, người đã từng được Henry hứa cưới sau cái chết của người tình lâu năm cũ là Gabrielle d'Estrées[3]. Thế nhưng, Henry đã cưới Marie thay thế, và đã dẫn đến những cuộc cãi vã và âm mưu thâm độc lẫn nhau của 2 người phía sau hậu trường. Dù nhà vua có thể dễ dàng đuổi tình nhân của mình, thế nhưng ông đã không làm vậy. Marie dưới tình thế đó, lại tỏ lòng trắc ẩn và xúi giục Henry đưa người vợ đã ly dị về triều, tức là Marguerite de Valois, Vương hậu Pháp.

Marie được đăng quang để trở thành Vương hậu nước Pháp vào ngày 13 tháng 5 năm 1610, một ngày trước vụ ám sát chồng bà. Vài giờ sau cái chết của Henry, Marie được Nghị viện Paris ủy thác làm nhiếp chính cho người kế vị, tức Louis XIII của Pháp. Bà trở thành Thái hậu, và ngay lập tức đuổi phu nhân Catherine d'Entragues ra khỏi triều đình[4].